Détection réussie et génotypage du virus de la rubéole provenant du cordon ombilical préservé de patients atteints de la rubéole congénitale

Détection réussie et génotypage du virus de la rubéole provenant du cordon ombilical préservé de patients atteints de la rubéole congénitale

Syndrome de rubéole congénitale, cordon ombilical préservé, enquête rétrospectiveLe syndrome de rubéole congénitale, d’abord documenté par Gregg , présente des manifestations multiples impliquant des systèmes d’organes multiples, y compris les systèmes ophtalmiques, auditifs, cardiovasculaires et encéphaliques. Manières tardives «permanentes» et «retardées» Bien que l’investigation des SRC puisse être facilitée par des informations sur la surveillance des maladies, il est difficile de confirmer les cas suspects dans les pays où la rubéole est complètement ou presque éradiquée. Des cas de rubéole symptomatique ou asymptomatique ont été rapportés dans la littérature. Des cas de CRS avec des manifestations strictement retardées sont susceptibles d’être manqués à la naissance. Pour de tels cas, les échantillons à investiguer peuvent être limités au moment où les symptômes se manifestent. de la rubéole , accumulation de CRS ca Certains cas totalement asymptomatiques à la naissance ont évolué vers des troubles de l’ouïe et / ou d’autres symptômes associés au SRC. En quête de spécimens potentiellement disponibles pour l’étude rétrospective des SRC, nous avons étudié cordons ombilicaux préservés, qui sont généralement conservés à vie comme une incarnation du lien maternofilial dans la culture japonaise

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Spécimens

Les spécimens de cette étude ont été recueillis avec le consentement éclairé du tuteur du patient et l’approbation éthique du comité de révision interne de notre institut. Des cordons ombilicaux préservés ont été fournis volontairement par des personnes diagnostiquées avec un SRC recruté dans une organisation de patients. diagnostiqué ailleurs, ainsi que des personnes sans signes ni circonstances indiquant CRS, servant de témoins négatifs En règle générale, la souche du cordon ombilical flétrie et / ou une petite partie du cordon ombilical coupé sont enveloppés dans du papier, du coton ou de la gaze et conservés dans une petite boîte en bois Données supplémentaires Un petit fragment d’approximativement mg ​​a été ébréché de chaque cordon ombilical préservé pour l’investigation. Le diagnostic de tous nos sujets, excepté ceux nés avant avril, est basé sur les critères sous lesquels tous les cas de SRC sont obligatoirement signalés. le système national de surveillance épidémiologique

Extraction d’ARN

L’ARN a été extrait comme décrit ailleurs En bref, l’ARN a été extrait par le réactif ISOGEN Nippon Gene Co, Ltd en combinaison avec un mini kit PureLink Thermo Fisher Scientific, et élué avec de l’eau sans nucléase dans des volumes correspondant à la masse du Dans le cas où l’ARNm de l’ARN messager de la glycéraldéhyde – phosphate déshydrogénase GAPDH était utilisé comme témoin pour l’extraction de l’ARN, une précipitation à haute teneur en sel a été effectuée et l’ARN a été réanalysé

Réaction en chaîne de la polymérase en temps réel

Deux ensembles d’amorces / sondes « A » et « B » pour la détection du virus de la rubéole RV, confirmés comme ayant des limites de détection comparables dans nos paramètres environ × copies / μL; Un autre jeu d’amorces / sondes a été utilisé pour détecter l’ARNm de GAPDH , comme contrôle de l’ARN extrait. L’ARN transcrit in vitro a servi de témoin positif anévrisme. Quatre microlitres de l’ARN élué ont été amplifiés dans un μL. réaction sur un système de détection CFX Bio-Rad Les conditions thermiques sont les suivantes: ° C pour les minutes et ° C pour les minutes, suivies des cycles d’amplification de ° C pour les secondes et de ° C pour les secondes

Génotypage

Chaque spécimen positif pour RV par au moins une méthode de détection a été soumis au génotypage Attendant une transcription efficace, l’ADN complémentaire a été transcrit en utilisant des -mers aléatoires Pour amplifier la fenêtre de séquençage -bp utilisée pour le génotypage , l’amplification les amorces, RV-gt-F et RV-gt-R, ont été tentées. En cas d’échec, un autre protocole amplifiant la fenêtre de séquençage en chevauchant des amplicons courts a été retenu du manuel domestique de détection des agents infectieux pour RV Les séquences amplifiées ont été séquencées chez Eurofins Genomics KK Tokyo, Japon. Les séquences déterminées ont été alignées sur les séquences des souches de référence de l’Organisation Mondiale de la Santé Trente-neuf séquences de RV déterminées au Japon entre et ont également été choisis dans GenBank pour être inclus dans cet alignement. En utilisant la fenêtre de séquençage -bp, un dendrogramme a été construit en utilisant le logiciel MEGA

RÉSULTATS

Spécimens soumis à l’analyse

Un total de spécimens de cordon ombilical ont été collectés et soumis à une enquête; provenaient d’individus diagnostiqués avec des échantillons CRS -, alors qu’ils provenaient d’individus sans signes ni circonstances indicatifs de CRS, servant de spécimens témoins négatifs et Les profils des individus dont les cordons ombilicaux ont été dérivés, et les résultats d’analyse mentionnés ci-après, sont résumés Tableau Tableau Contexte de l’étude Sujets et résultats Spécimen Non Statut Année / Semaine de naissance Triades CRS Détection / ΔCt Accession Noa CA HL DCC Ensemble A Ensemble B CRS / – – – – AB CRS / ND CRS / – ND CRS / – CRS / – – AB CRS / – – NC / – – – ND ND NC / – – – ND ND Spécimen Non Statut Année / Semaine de naissance Triades CRS Détection / ΔCt Accession Noa CA HL CCD Ensemble A Ensemble B [ ] CRS / – – – – AB CRS / ND CRS / – ND CRS / – CRS / – – AB CRS / – – NC / – – – ND ND NC / – – – ND ND Une valeur ΔCt négative indique que le cycle seuil de l’échantillon était plus petit que l’ARN témoin, c’est-à-dire que l’échantillon s’est avéré positif plus vite que le témoin. cycles de l’échantillon et ARN témoin de × copies / réaction; CA, cataracte; CCD, maladie cardiovasculaire congénitale; CRS, syndrome de rubéole congénitale; HL, perte / déficience auditive; NC, contrôle négatif; ND, non détectéa À partir de la banque de données ADN du Japon DDBJ

Réaction en chaîne de la polymérase en temps réel

Tous les échantillons de CRS se sont avérés positifs pour RV par l’ensemble amorce / sonde B; Les échantillons témoins négatifs sont restés négatifs pour les deux méthodes de détection RV Tous les échantillons se sont avérés positifs pour l’ARNm de GAPDH, ce qui suggère une extraction réussie de l’ARN, bien que les spécimens témoins négatifs aient nécessité des précipitations additionnelles élevées

Génotypage

Selon le dendrogramme, ces séquences se regroupent le plus étroitement avec le clade B, proche des séquences du Japon.

DISCUSSION

Dans ce rapport, RV a été détecté avec succès à partir de cordons ombilicaux préservés de tous les cas de CRS par PCR en temps réel. Malgré la dégradation potentielle de l’ARN pendant la conservation et d’autres procédures de traitement des échantillons, nous avons réussi à génotyper la séquence virale. spécimens L’exactitude et la fiabilité de ces séquences ont été suggérées, car elles sont étroitement liées à d’autres séquences déterminées au Japon entre et Au meilleur de nos connaissances, il n’y a pas de rapports d’utilisation de cordon ombilical préservé pour la détection ou le génotypage de VR dans la littératureDans la plupart des études rétrospectives En ce qui concerne les infections, la disponibilité de spécimens d’intérêt est rare, en particulier chez les individus apparemment sains. Néanmoins, plusieurs études rétrospectives réussies d’infections virales prénatales dans les pays développés ont été rapportées, comme l’utilisation de cartes de Guthrie sang de cordon ombilical Cependant, ces spécimens sont pas toujours facilement accessible; Les cartes de Guthrie sont conservées dans les agences de santé publique et le sang de cordon ombilical est généralement cryoconservé dans des installations désignées. En revanche, les cordons ombilicaux préservés conservés chez le patient sont facilement accessibles. cordes pour l’étude rétrospective des infections prénatales à la fois par les virus à ADN et à ARN La disponibilité du cordon ombilical préservé pourrait être considérée comme une limitation de notre étude, certains pouvant penser que cela est limité au contexte culturel japonais. Données complémentaires Ainsi, en prêtant attention au contexte culturel des patients, des investigations similaires pourraient être possibles dans le monde entier. Il y a plusieurs limites à notre étude. Premièrement, le nombre de spécimens évalués n’était pas assez important pour discuter de la sensibilité. / spécificité Nonethe moins, nous avons démontré la pertinence du cordon ombilical préservé comme un échantillon pour la détection moléculaire rétrospective de RV dans les cas suspectés de CRS Deuxièmement, la précision du diagnostic du patient le plus âgé, né en, était incertaine. des atteintes ophtalmiques, auditives et cardiovasculaires du SRC; Table ; combiné avec le fait que le Japon a connu une épidémie de rubéole en , des preuves étayant le diagnostic de ce cas semblent suffisantes Troisièmement, le génotypage n’était pas possible pour les échantillons CRS En plus de la dégradation potentielle de l’ARN pendant la conservation, la procédure d’extraction peut avoir augmenté le risque de cisaillement de l’ARN en fragments trop courts pour servir de matrices pour les nucléotides de détermination de séquence, mais encore permis pour les nucléotides de détection PCR en temps réel. La concentration d’ARN favorise le génotypage Par conséquent, une optimisation supplémentaire de la procédure d’extraction pour surmonter ces facteurs peut améliorer la pertinence de l’ARN extrait comme modèle pour le génotypage, ainsi que pour la détection en temps réel par PCR, augmentant ainsi la valeur du cordon ombilical préservé. un spécimen d’investigation moléculaire rétrospective Un diagnostic définitif peut permettre d’initier des soins adéquats plus tôt, et une preuve substantielle d’infection prénatale peut également fournir des réponses aux patients qui souhaitent connaître la cause de leurs problèmes de santé. De plus, le diagnostic d’autres cas de SRC manqués peut aider à dévoiler des aspects et / ou des manifestations inconnus du syndrome. Cependant, la confirmation actuelle du laboratoire par le SRC devient très difficile après l’année; Dans de telles situations, le cordon ombilical préservé peut servir de spécimen alternatif qui prolonge cette limite anormale. En conclusion, ceci est le premier rapport de détection réussie et de génotypage de RV à partir de spécimens de cordon ombilical conservés de patients atteints de SRC. Les données confirment que le cordon ombilical préservé constitue une archive utile d’informations prénatales et qu’il peut être utilisé pour des investigations rétrospectives sur d’autres infections prénatales.

Remarques

Remerciements Cette étude a été approuvée par le Comité d’examen interne du Centre national pour la santé infantile et le développement, Japon NCCHD Les auteurs remercient le Dr Julian Tang du Département de l’éducation pour la recherche clinique, NCCHD, pour avoir révisé ce manuscrit. pour fournir leurs cordons ombilicaux préservés Soutien financier Ce travail a été soutenu par NCCHD, numéro de subvention au Japon – Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit signaléTous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits potentiels Conflits d’intérêts que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués

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